В 1522 году на остров высадилось невиданное ранее количество солдат. 400 кораблей под командованием султана Сулеймана Великолепного доставили 200 000 солдат. Госпитальеры под командованием великого магистра Филиппа Вилларе де Л’айл-Адама, могли противопоставить этой силе 7000 солдат, а также фортификационные сооружения. После окончания осады, продолжавшейся 6 месяцев, выжившим госпитальерам позволили отступить на Сицилию.
Мальтийские рыцари
Герб госпитальеров, смешанный с частями герба Пьера д’Обюссона, на пушке которую он заказал. Надпись сверху гласит: «F. PETRUS DAUBUSSON M HOSPITALIS IHER».
После семи лет скитаний по Европе госпитальеры обосновались в 1530 году на Мальте, после того как испанский король Карл V, будучи также королем Сицилии, отдал госпитальерам в постоянное феодальное владение Мальту, Гоцо и северо-африканский порт Триполи. Ежегодной платой за эту услугу должен был стать один мальтийский сокол, присылаемый в день всех святых королевскому представителю, вице-королю Сицилии. (Этот исторический факт использован в качестве завязки в знаменитой книге Дэшила Хэммета Мальтийский сокол).
Госпитальеры продолжили борьбу против мусульман, в особенности против северо-африканских пиратов. Несмотря на то, что в их распоряжении находилось всего лишь несколько кораблей, они очень быстро навлекли на себя гнев Османов, недовольных переселением ордена. В 1565 году Сулейман I направил сорокатысячную армию для осады Мальты и изгнания с её территории 700 рыцарей и 8000 солдат.
Поначалу сражение складывалось для госпитальеров столь же неудачно, как и сражение на Родосе: большая часть города была разрушена, около половины рыцарей убито. К 18 августа положение осажденных стало практически безнадежным. Ежедневно сокращаясь в количестве, они вскоре стали неспособны удерживать растянутую фортификационную линию. Однако, когда совет предложил покинуть II Борго и Сенглиа и отступить к форту Святого ангела, великий магистр Жан Паризо де ла Валетт отверг это предложение.
Вице-король Сицилии не прислал помощи. По всей видимости, приказы испанского короля Филиппа II вице-королю Сицилии были настолько туманно изложены, что он не решился взять на себя ответственность и оказать помощь госпитальерам в ущерб собственной обороне. Неправильное решение могло привести к поражению, а следовательно, подвергнуть османской угрозе Сицилию и Неаполь. Вице-король оставил с ла Валлетом своего сына, и ему вряд ли могла быть безразлична судьба крепости. Что бы ни было причиной задержки, вице-король продолжал колебаться до тех пор, пока судьба сражения не была практически решена усилиями лишённых помощи госпитальеров, и даже тогда только негодование собственных офицеров вынудило его двинуться на помощь.
Реконструкция строевых учений, проводимых госпитальерами в 16-ом столетии. Форт Святого Эльма, Валлетта, Мальта, 8 мая 2005.
23 августа последовала ещё одна мощная атака. По свидетельствам осажденных это было последнее серьёзное усилие. С большим трудом, даже раненым приходилось принимать участие, атака была отражена. Положение осажденных, однако, не выглядело безнадежным. За исключением форта Святого Эльма, фортификации госпитальеров были все ещё невредимы. Работая днем и ночью, гарнизон сумел устранить бреши в укреплениях, после чего взятие Мальты казалось все более невыполнимой задачей. Из-за ужасной жары и тесноты казарм многие турецкие солдаты болели. Заканчивались еда и боеприпасы, турецкие солдаты все больше впадали в уныние из-за тщетности их атак и понесенных потерь. Серьёзным ударом стала гибель опытного командира, капера и адмирала османского флота Драгута 23 июня 1565 года. Турецкие командиры Пиаль Паша и Мустафа Паша были слишком беспечны. Они располагали огромным флотом, который они лишь единожды удачно использовали. Они также пренебрегли связью с африканским побережьем и не предприняли ни одной попытки выследить и воспрепятствовать переброске подкреплений с Сицилии.
1 сентября турки предприняли последнюю попытку, однако боевой дух османских войск упал, и к великой радости осажденных, увидевших путь к спасению, попытка оказалась тщетной. Озадаченные и нерешительные османы узнали о прибытии подкреплений с Сицилии в бухту Миллиа. 8 сентября, не зная, что подкрепление очень невелико, турки сняли осаду и отступили. Великая осада Мальты, должно быть, была последним сражением в котором войско, состоящее из рыцарей, одержало решительную победу.
После отступления османов в строю у госпитальеров оставалось 600 человек. Согласно наиболее достоверной оценке, турецкая армия насчитывала 40 000 человек, из которых, в итоге, 15 000 вернулись в Константинополь. Осада ярко изображена на фресках Маттео Переса д`Алеччо в Холле Святого Михаила и Святого Георга, также известного как Тронная Зала, который находится в замке Великого Магистра в Валетте. Четыре оригинальных эскиза, написанные маслом Маттео д’Алеччо между 1576 и 1581 годами, можно увидеть в Квадратной Комнате Дворца Королевы в Гринвиче, Лондон. После осады был построен новый город — сегодня он носит имя Валетта, в память о великом магистре, который его отстоял.